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細(xì)胞骨架的熒光探針標(biāo)記方法

更新時間:2016-08-11      點(diǎn)擊次數(shù):6265

細(xì)胞骨架主要有微管(micmtuble, MT),微絲(microfilament, MF),中間絲(intermediate filament, IF三種類型。它們分別由不同的蛋白單體組裝而成,其中微管蛋白(tubulin)、肌動蛋白(actin)、波形蛋白(vimentin)等是細(xì)胞骨架的重要組成部分,也是zui常被研究的細(xì)胞骨架蛋白。

1963年.Slauterback采用戊二醛常溫固定方法.首先使用電鏡在水螅刺細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了微管。隨后,微絲和中間絲相繼被發(fā)現(xiàn)。它們廣泛存在于真核細(xì)胞中.細(xì)胞骨架蛋白的含量占細(xì)胞總蛋白含量的10%-30%。它們與細(xì)胞形態(tài)的維持,細(xì)胞器的空間定位及位置改變.細(xì)胞的運(yùn)動。細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸,細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo),免疫行為和細(xì)胞分裂等活動有密切的關(guān)系。

一、細(xì)胞骨架的熒光探針標(biāo)記方法

1. 微管蛋白(tubuline)的標(biāo)記

一般使用間接標(biāo)記的方法,一抗為抗tubulin單抗,二抗為抗小鼠IgG的熒光抗體,就可以展現(xiàn)出固定細(xì)胞,冰凍切片的微管結(jié)構(gòu)。這種小鼠來源的單抗識別微管N端結(jié)構(gòu)域的第69-97個氨基酸殘基。同時也是用于ELISA和Western blotting的抗體。檢測微管的其他探針有:Bis-ANS是離體狀態(tài)下微管裝配的強(qiáng)抑制劑,熒光探針與蛋白的疏水裂隙結(jié)合,且結(jié)合后熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。用于檢測微管蛋白時間和溫度依賴性的解聚。DCVJ(4-(dicyanovinyl) julolidine) 用于活細(xì)胞微管蛋白裝配動態(tài)過程的探針。它的作用可被細(xì)胞松弛素D(cytochalasin D) 所阻斷。

2. 微絲的標(biāo)記

用鬼筆環(huán)肽(phalloidin)標(biāo)記。鬼筆環(huán)肽是從一種菌類Amanita Dhalloides所提取出來的環(huán)肽。它與F—actin競爭性的結(jié)合。熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽在納克水平就可與F-actin選擇性的結(jié)合并且易溶于水.為檢測組織切片.培養(yǎng)細(xì)胞和無細(xì)胞體系中的actin的定位和定量提供了非常方便的標(biāo)記方法。在肌細(xì)胞和其他細(xì)胞中鬼筆環(huán)肽與actin亞單位一比一結(jié)合。并且不與G-actin結(jié)合。鬼筆環(huán)肽比actin的抗體標(biāo)記有*性。首先,在不同種類生物中它的結(jié)合性質(zhì)不發(fā)生改變。其次.鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的非特異性信號可忽略.因而圖像的反差較好。

3. 其他細(xì)胞骨架蛋白的標(biāo)記

抗波形蛋白(vimentin)抗體??鼓z質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)抗體,抗結(jié)蛋白抗體(Anti-Desmin Antibody)等。

二、細(xì)胞骨架的共聚焦研究技術(shù)

1. 激光共聚焦顯微鏡的工作原理

激光共聚焦顯微鏡選用單色性好,單向性好的激光作為光源。激光通過一個照明針孔到達(dá)樣品,樣品只被一個具有精密幾何形狀的光點(diǎn)照射在焦平面上,只有被照射到的特定點(diǎn)所發(fā)射的熒光通過探測針孔到達(dá)檢測器.該點(diǎn)以外的任何發(fā)射熒光均被該針孔阻擋。照明針孔與探測針孔對被照射點(diǎn)或被探測點(diǎn)來說是共軛的.這就是激光掃描共焦顯微鏡系統(tǒng)中共焦的真正含義。激光共聚焦顯微鏡利用光電倍增管采集和放大信號。計算機(jī)以像點(diǎn)的方式將成像點(diǎn)顯示在屏幕上,由光路中的掃描系統(tǒng)在整個樣品上掃描.在顯示器上產(chǎn)生一幅完整圖像。這幅圖像即為焦平面的共焦圖像。只要載物臺沿著Z軸上下移動.將樣品新的一個層面移到共焦面上.樣品的這個新層面又成像在顯示器上。隨著Z軸的不斷移動.就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像。我們將從共聚焦顯微鏡系統(tǒng)獲得的連續(xù)光切圖像比喻為顯微CT,從這些連續(xù)的光切圖像可通過三維重組模擬出樣品真實(shí)的立體結(jié)構(gòu)。共聚焦顯微鏡憑借其*的成像原理大大提高了分辨率,它在X-Y平面的橫向分辨率比普通的顯微鏡要高出約40%,而且它還可以對厚樣本進(jìn)行非介入無損傷性連續(xù)光學(xué)切片,得到三維重組的空間立體圖像。近十年來,人們已廣泛應(yīng)用CLSM來觀察和分析細(xì)胞內(nèi)的微細(xì)結(jié)構(gòu)和分子在細(xì)胞內(nèi)的分布,觀察細(xì)胞內(nèi)離子,蛋白分子的變化,包括細(xì)胞內(nèi)鈣,活性氧,轉(zhuǎn)錄因子,表面分子,細(xì)胞凋亡,細(xì)胞膜流動性,細(xì)胞內(nèi)分子的運(yùn)動.細(xì)胞間的縫隙連接,蛋白間的相互作用等。共聚焦的分析研究已經(jīng)涉及了生物學(xué)的幾乎所有領(lǐng)域。

2. 激光共聚焦的圖像采集和圖像處理與數(shù)據(jù)分析方法

將制備好的細(xì)胞放在熒光顯微鏡的載物臺上進(jìn)行觀察找到需采集的視野,將熒光顯微鏡轉(zhuǎn)到掃描的位置。根據(jù)樣品的實(shí)際情況.在控制軟件的界面中選擇圖像采集的參數(shù),包括激發(fā)光的波長,發(fā)射光的范圍,掃描模式,掃描速度,探測針孔,電子放大倍數(shù)等參數(shù)。啟動預(yù)掃,并調(diào)節(jié)光電倍增管的電壓PMT,Z軸的位置等,調(diào)節(jié)屏幕的圖像的細(xì)節(jié)清晰銳利,然后采集圖像。還可設(shè)定z軸的一定范圍。按照設(shè)定的步距進(jìn)行光學(xué)切片。采集得到的圖像還可以通過圖像處理和數(shù)據(jù)分析得到所需要的數(shù)據(jù)和圖像。三維光切的圖像可以顯示為假三維的疊加圖.還可以用軟件實(shí)現(xiàn)三維重組得到細(xì)胞和組織的空間圖像。

3.卵細(xì)胞紡錘體的激光共焦研究技術(shù)

以下就以家兔卵細(xì)胞的紡錘體的共焦研究為例來說明細(xì)胞骨架共焦研究技術(shù)和方法。

1)MII期卵母細(xì)胞紡錘體的熒光染色:卵母細(xì)胞經(jīng)以下步驟處理

a. 固定及透化液(2%甲醛+0.1%Triton X-100+1μg/ml taxol),30min。

b. PBS 3次,每次15min。

c. 封閉劑(PBS+2%BSA+2%正常羊血清+2%脫脂奶+0.01%Triton X-100+0.02%疊氮鈉+0.1mol/L甘氨酸)4℃隔一晚。

d. 鼠微管蛋白單克隆抗體(mouse monoclonal anti-a-tubulin)孵育30—60min。

e. 封閉液沖洗3次,15-20min/次。

f.  FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG孵育30min, PBS洗3次。

g. 加入PI(碘化丙啶)0.5μg/ml, 10min,PBS洗2次。

所有步驟均在37℃下進(jìn)行。標(biāo)本使用LEICA LCSSP2 Laser Scanning Confocal Microscope LCS軟件采集和處理圖像。

2) 圖像采集的儀器條件

物鏡采用HCX PL APO CS 63/1.32 OIL UV。雙通道采集信號,*通道激發(fā)波長為488nm,發(fā)射波長為515-535nm。第二通道激發(fā)波長為543nm,發(fā)射波長為590-630nm。采集模式為xyz,Pinhole為1.60,z軸的總厚度為10.36mm,Z軸以1.4mm為步距連續(xù)光切。

三、激光共焦顯微鏡在細(xì)胞骨架研究中的優(yōu)勢

1. 分辨率高.激光共焦顯微鏡比傳統(tǒng)顯微鏡的分辨率高1.4倍。對于觀察細(xì)胞骨架等微細(xì)結(jié)構(gòu)比傳統(tǒng)熒光顯微鏡*。共焦顯微鏡只采集到樣品焦平面的像.使細(xì)胞骨架的像更加清晰。

2. 激光共焦顯微鏡實(shí)現(xiàn)了對樣品的不同層面進(jìn)行掃描從而產(chǎn)生不同層面的共焦圖像。細(xì)胞骨架和細(xì)胞骨架所形成的一些結(jié)構(gòu)。如紡錘體都具有一定的空間分布.利用激光共焦顯微鏡可以對這些結(jié)構(gòu)進(jìn)行無損傷的連續(xù)三維光切,形成他們的疊加圖像.或經(jīng)過共焦的圖像處理,三維重組得到他們的立體圖像。這一點(diǎn)是其他的檢測方法所無法做到的。

3. 與電鏡相比,標(biāo)本制備要簡便的多,既省時又省力。還可以避免標(biāo)本制備過程中的假陽性。

綜上所述.激光共焦顯微鏡因?yàn)槠?的成像原理決定了它在細(xì)胞骨架研究中的重要地位。這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展為人類更好的認(rèn)識和研究細(xì)胞骨架的功能及其與疾病的關(guān)系提供了很好的研究手段。

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